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ProteanFect Max (PT02) 轉染人源CD34+造血干細胞操作攻略
CD34+造血干細胞的分選
對于人源CD34+造血干細胞，合適的培養(yǎng)條件和轉染時間對細胞的成功轉染非常關鍵。CD34+造血干細胞分選后需要培養(yǎng)一段時間恢復細胞狀態(tài)后，以實現較高的轉染效率。以來自動員人單采血或臍帶血開始，可以使用市面上陽性選擇分選試劑盒分離得到CD34+細胞群。本實驗所用細胞為動員人單采血，分離試劑為Lymphoprep™（Stemcell，07861），分選試劑盒為CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）。具體實驗操作參考其官·方說明書。
注：在紅細胞數量較多的情況下，應先分離PBMC，再使用試劑盒進行分選。具體操作應根據所選材料和試劑盒說明書進行細胞分選。
CD34+造血干細胞完·全培養(yǎng)基的配制
SFEM II培養(yǎng)基（Stemcell，09655）和StemSpan™ CC100（Stemcell，02690）以99：1比例充分混合后使用（若添加抗生素則抗生素稀釋1000倍），配置完培養(yǎng)基放置于4℃冰箱儲存（盡量在1個月內使用完）。
CD34+造血干細胞的培養(yǎng)與傳代
1.分選得到的CD34+造血干細胞300 g離心5 min，用1 mL完·全培養(yǎng)基重懸后，取樣計數，根據計數結果用完·全培養(yǎng)基重懸到105 cells/mL活細胞密度，接種到T25培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。
培養(yǎng)容器 | 每孔體積 | 細胞密度 |
T25 | 8.0 mL | 105 cells/mL |
6-well plate | 2.5 mL | 105 cells/mL |
24-well plate | 1.0 mL | 105 cells/mL |
48-well plate | 0.5 mL | 105 cells/mL |
2.3天后補液一次，調整細胞密度至2×105 cells/mL，之后隔天補液調整密度至2×105 cells/mL ，培養(yǎng)時細胞密度控制在1.5×106cells/mL 以內。
注：若不及時補液，細胞狀態(tài)及后續(xù)擴增受不可逆影響。
3.推薦在CD34+造血干細胞分離后培養(yǎng)5-10天進行轉染。如果細胞分離后直接轉染或細胞傳代時間過長后再轉染，轉染后的細胞活力與轉染效率可能會降低或者CD34+造血干細胞比例偏低。對于使用上述動員單采血來源的CD34+造血干細胞，最佳的轉染時間點是在分離培養(yǎng)后的第5天。
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使用ProteanFect Max（PT02)進行人CD34+造血干細胞轉染
1.轉染的核酸：mRNA
2.適合轉染的培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基（或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養(yǎng)基）進行轉染。
3.配置ProteanFect Max轉染體系：具體詳見表1-3。轉染體系在配置過程中出現粘稠現象屬于正常。
4.轉染前細胞準備：確保細胞處于良好生長狀態(tài)，活率需超過90%。調整細胞轉染密度時，避免反復離心，以免延長處理時間，影響細胞活力和轉染效率。
5.細胞轉染：孵育時間建議保持在15分鐘，適當延長時間可提高轉染率，但可能影響細胞活力。
6.轉染效率與細胞活率檢測：使用陽性對照mRNA時，可在轉染后5-48小時內觀察EGFP的表達。細胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍、AO/PI染色或流式細胞術等方法檢測，若細胞狀態(tài)良好，鏡下觀察可見細胞圓潤透亮。
表1. ProteanFectMax轉染人源CD34+造血干細胞實驗操作步驟說明
（以96孔板轉染mRNA為例）
操作步驟 | 人源CD34+造血干細胞 |
1 配置ProteanFect Max轉染體系 | |
1.1 將Reagent A與mRNA混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混勻（Reagent A使用前需顛倒混勻） |
1.2 加入Reagent B輕柔充分混勻 | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B混勻一分鐘（動作輕柔避免產生氣泡） |
1.3 加入Reagent C混勻 | 往上述混合物中加入8-13.5 μL Reagent C混勻（動作輕柔避免產生氣泡）a |
2 轉染前細胞處理 | |
2.1人源CD34+造血干細胞準備（洗滌盡量去除培養(yǎng)基，以免影響轉染效果） | 取1×105 CD34+造血干細胞，加入Opti-MEM，300 g離心5分鐘，去上清，收集細胞沉淀，加入Opti-MEM重懸再洗滌一次，用20 μL Opti-MEM重懸細胞調至1×10? cells/mL備用 |
3 細胞轉染 | |
3.1混合轉染體系與細胞 | 將上述ProteanFect轉染液與20 µL細胞懸液混合均勻（動作輕柔避免產生氣泡） |
3.2 孵育 | 37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘 |
3.3 終止反應與洗滌 | 加入至少200 µL完·全培養(yǎng)基，300 g離心5分鐘，棄上清（殘留約20μL液體） |
3.4 細胞培養(yǎng)與觀察 | 加入適量完·全培養(yǎng)基，進行細胞培養(yǎng)，后續(xù)可根據實驗目的進行基因表達檢測 |
a. 由于人源CD34+造血干細胞的個體差異較大建議先加入13.5 μL的Reagent C。如果細胞活率不佳，可將Reagent C的使用量下調至8 μL。
表2. ProteanFect Max轉染不同類型核酸的實驗操作步驟說明（以96孔板轉染為例）
操作步驟 | 人源CD34+造血干細胞 | |
1 配置ProteanFect轉染體系 | mRNAa | siRNAb |
1.1 將Reagent A與核酸混合 | 在40 µL Reagent A中加入0.5 µg mRNA，充分混勻 | 在40 µL Reagent A中加入40 pmol siRNA，充分混勻 |
1.2 加入Reagent B | 往上述混合物中加入0.7 μL Reagent B | 往上述混合物中加入1.4 μL Reagent B |
1.3 加入Reagent C | 往上述混合物中加入8 μL Reagent C | 往上述混合物中加入13.5 μL Reagent C |
2轉染前細胞處理 | 詳見表2 | |
3 細胞轉染 | 詳見表2 | |
a. 建議mRNA濃度≥1 μg/mL。如需同時轉染多個mRNA，為確保在轉染多個mRNA時保持高效的轉染效果，加入的mRNA總量為0.5 µg。
b. 建議siRNA濃度≥20 μM。如需同時轉染多個siRNA，為確保在轉染多個siRNA時保持高效的轉染效果，加入的siRNA總量為40 pmol。
表3. ProteanFect Max轉染不同細胞培養(yǎng)孔板規(guī)格的各組分使用量
a. 由于CD34+造血干細胞存在較大個體差異，建議對Reagent C進行多個梯度測試，以綜合考慮細胞活率和轉染效率，從而選擇最佳方案。Reagent C的使用量可低下調至初始量的50%。
細胞活率和表達效率分析
在轉染 EGFP mRNA后，可通過臺盼藍染色和流式細胞術對CD34+造血干細胞轉染后的細胞活力與轉染效率進行分析。首先通過熒光顯微鏡對轉染后細胞的EGFP蛋白質表達、細胞形態(tài)和活力進行定性評估（圖 1）。同時，收集轉染后的細胞進行臺盼藍染色檢測活細胞密度，流式染色PE anti-human CD34 Antibody（Biolegend ,343506）以定量分析CD34+造血干細胞的轉染效率。細胞收集完成后，離心棄去培養(yǎng)基，用1 × DPBS重懸細胞，加入PE anti-human CD34 Antibody，4℃避光染色15分鐘后洗滌去上清，用1 × DPBS重懸細胞，進行流式檢測（圖2）。
圖1. 利用ProteanFect Max轉染EGFP mRNA在人源CD34+造血干細胞中的表達。熒光圖（左）和明場圖（右）顯示，ProteanFect Max轉染人源CD34+造血干細胞中1天后。絕大部分細胞表達綠色熒光蛋白，說明ProteanFect Max在人源CD34+造血干細胞中中具有較高的轉染效率。
圖2. 利用ProteanFect Max轉染EGFP mRNA在人源CD34+造血干細胞中表達的流式分析圖。使用ProteanFect Max轉染試劑轉染EGFP mRNA，在轉染后24小時檢測到約有61.9%細胞表達EGFP蛋白。
常見問題
1. 如何提升轉染效率
1）延長轉染時間：根據細胞狀態(tài)適當延長轉染時間，通常不超過30分鐘。
2. 關于試劑盒中陽性對照的使用建議
首·次嘗試時，建議設置陽性對照組（EGFP mRNA），以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用96孔板的細胞量即可，節(jié)省細胞和試劑。
2. 轉染時的細胞數范圍
說明書中提供了最佳轉染條件下的細胞數量范圍，但在特殊情況下，即使細胞數量較少，也可以進行轉染。以96孔板為例，建議細胞數量不低于2×105/孔，以確保后續(xù)檢測的可靠性。
3. 轉染后細胞狀態(tài)與活力
轉染后，細胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進行轉染時，對細胞活力的損傷較小。通常在轉染3天后，細胞狀態(tài)會基本恢復。
4. 轉染后細胞離心后看不到沉淀
對于小體積轉染體系（如96孔板），離心后細胞沉淀不明顯是正常現象。細胞沉淀可能散落在離心管側壁，不影響后續(xù)結果。為減少細胞損失，離心后移液時應避免槍頭緊貼底部。
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